该方法包括:S1,达托霉素中间体料液初步纯化,用第一纳滤膜进行第一次浓缩;S2,将第一浓缩液的pH调至4.0~8.0,上入装有单分散聚合物填料的层析柱第一次吸附;洗脱,得到第一洗脱液;S3,采用第二纳滤膜对第一洗脱液进行第二次浓缩;S4,将第二浓缩液上入装有反相硅胶填料的制备柱中吸附;洗脱,得到第二洗脱液;S5,采用第三纳滤膜对第二洗脱液进行第三次浓缩;S6,将第三浓缩液进行超滤膜脱色和去内毒素,用第四纳滤膜进行第四次浓缩,得到第四浓缩液;S7,调节第四浓缩液pH至3.0~6.0,冻干,得到成品。将该方法用于提取达托霉素,具有更高的产品纯度和纯化收率。