该方法包括：S1，达托霉素中间体料液初步纯化，用第一纳滤膜进行第一次浓缩；S2，将第一浓缩液的pH调至4.0～8.0，上入装有单分散聚合物填料的层析柱第一次吸附；洗脱，得到第一洗脱液；S3，采用第二纳滤膜对第一洗脱液进行第二次浓缩；S4，将第二浓缩液上入装有反相硅胶填料的制备柱中吸附；洗脱，得到第二洗脱液；S5，采用第三纳滤膜对第二洗脱液进行第三次浓缩；S6，将第三浓缩液进行超滤膜脱色和去内毒素，用第四纳滤膜进行第四次浓缩，得到第四浓缩液；S7，调节第四浓缩液pH至3.0～6.0，冻干，得到成品。将该方法用于提取达托霉素，具有更高的产品纯度和纯化收率。